龋病是在以细菌为主的多种因素影响下，牙体硬组织发生慢性进行性破坏的一种疾病^[1]。釉质龋是指发生在釉质内的龋病病变，基本病理变化为脱矿和再矿化^[3]。早期釉质龋未出现牙体组织缺损的可采用非手术治疗，包括药物疗法、再矿化治疗法、预防性树脂充填治疗方法，一旦牙体组织出现缺损，需采用修补治疗的方法。其中，非手术治疗中的再矿化治疗是采用人工方法使脱矿釉质或牙骨质再矿化，恢复其硬度，终止或消除早期龋损^[1]。所以，寻找能促进早期釉质龋再矿化的防龋药物一直是预防医学的研究焦点。

黄瓜籽为黄瓜（Cucumis sativus）的种子，虽然常被我们食用黄瓜时丢弃，但在传统医学被视为有价值的中药，通常经过炒制磨粉使用，尤其在中医和民间疗法中占有重要地位^[4][5]。黄瓜籽的功效源于密集的营养成分，具有丰富的矿物质，如钙、镁、磷、钾等；抗氧化与抗炎成分，如酚类化合物、黄酮及植物甾醇等；必需氨基酸，不饱和脂肪酸及维生素^[4][5]。

研究表明，无论是在体内还是在体外，矿物溶解或沉积的基本物理化学条件是环境溶液中对于该种矿物的饱和状态^[1]。所以，从脱矿与再矿化化学机制角度分析，黄瓜籽有可能成为天然的再矿化药物应用于临床。有研究证实，黄瓜籽醇提取物对脱矿釉质有再矿化作用^[6]。但黄瓜籽醇提取物，提取过程较为复杂，且提取过程中容易丢失黄瓜籽中大量营养物质，所以本实验通过观察不同浓度黄瓜籽水提取物Water extract of Cucumis sativus seeds，CSW）是否对早期釉质龋有再矿化能力的影响，为早期釉质龋的防治提供新的思路及方法。

1 材料与方法

1.1 仪器设备 高速中药研磨机（浙江省兰溪市伟能达公司）、电子天平（上海天平仪器厂）、数显恒温水浴锅（常州丹瑞实验仪器设备有限公司）、循环水多用真空泵（北京瑞成伟业仪器设备有限公司）、旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）、冷冻干燥机（上海皓庄仪器有限公司）、双频数控超声波清洗器（昆山超声仪器厂）、打磨机（天津市仁合峻成科技公司），电热恒温水箱（天津市泰斯特仪器有限公司）、电子探针JXA-8230（日本电子公司）。

1.2 试剂材料 脱矿液^[7]：50 mmol／L乙酸，1.5 mmol／L氯化钙，0.9mmol／L磷酸二氢钾，氢氧化钾将pH调制5.0（东莞市信恒科技有限公司）；人工唾液^[7]：（ISO/TR10271标准）NaCl 0.4 g，KCl 0.4 g，CaCl₂·2H₂O  0.795 g，NaH₂PO₄·2H₂O  0.78 g，Na₂S·2H₂O  0.005 g，尿素1.0 g，蒸馏水稀释至1000 mL，pH 值为6.8（东莞市信恒科技有限公司）；NaF溶液（20 mg/mL）（东莞市信恒科技有限公司）；0.9%生理盐水，以上试剂均为分析纯。黄瓜籽炒制品购于牡丹江市中医医院。

1.3.1黄瓜籽水提取物的制备取黄瓜籽炒制品，用高速中药粉研磨机研碎，蒸馏水浸泡48h，用去离子水超声提取 3 次，每次 3 h，将滤液收集后抽滤。抽滤后的滤液用旋转蒸发仪蒸发浓缩，再用冷冻干燥机冻干，得到CSW晶体，-4℃保存。

1.3.2黄瓜籽水提取物溶液的制备称取的黄瓜籽水提取物晶体，分别溶解于蒸馏水中，配置成10mg/mL，20mg/mL，40mg/mL，60mg/mL的CSW，室温保存。

1.4 .1离体牙的处理收集口腔外科拔除的正畸患者减数无龋坏前磨牙，除去冠部残留软组织，将冠髓剔除，去离子水冲净，超声清洗30 min，选择无裂痕、大小均一的离体牙冠，浸泡于生理盐水中，密封后放入-4 ℃的冰箱保存。

1.4 .2釉质块的制备离体牙自然晾干，用蜡包埋后，分别在流水冷却下切割成小块，选取牙冠同一部位的釉质小块，丙烯酸树脂包埋。将所得的试件分别在流水下依次用80,1000,2500目的碳化硅砂纸磨平抛光（磨除厚度约0.1mm），在所得的60个釉质试件上涂布抗酸指甲油，露出5mm×5mm的釉质开窗^[7]。

1.5 实验的分组及处理将60个试件随机分成6组（n=10），分别为去离子水组（阴性对照组），20mg/mLNaF组（阳性对照组），10mg/mLCSW组，20mg/mLCSW组，40mg/mLCSW组，60mg/mLCSW组。在37℃水浴恒温箱中，将试件浸入100mL脱矿液（pH＝5.0）48小时，形成脱矿病变。人工龋制备完成后，分别用去离子水、20mg/mLNaF、10mg/mL ，20mg/mL， 40mg/mL,60mg/mLCSW中浸泡10min，自然晾干5 min，去离子水冲洗1min，2 次/天，分别为每天的7: 00 和19: 00，共计14 天。间隔期浸泡于人工唾液，保持在37℃水浴恒温箱中，每24 h 更换一次人工唾液^[6]。

1.6.1  表面形貌分析  将脱矿前、脱矿后及再矿化后的试件进行常规脱水，真空干燥、喷金，电子探针JXA-8230下观察表面超微结构。

2 结果

2.1.1肉眼观察

    脱矿后的各组釉质表面均失去光泽呈白垩色改变。经CSW处理后釉质表面白垩色改变有不同程度减轻。20mg/mLNaF组组的釉质标本表面白垩色斑点最少。去离子水组的釉质表面仍呈白垩色。

2.1.2  电子探针JXA-8230下观察表面超微结构

电子探针下观察超微结构,如图1。脱矿前，釉质表面光滑平坦，无明显孔隙（A）。脱矿后，釉质表面凹凸不平，釉柱中心溶解，呈蜂窝状（B）。再矿化后，去离子水组，表层仍为脱矿后形态（C）。20mg/mLNaF组，表面平整光滑，有紧密均匀的球形矿物质沉积（D）。10mg/mL、20mg/mL、40mg/mL、60mg/mLCSW组，均有较疏松的颗粒沉积物生成，颗粒的大小体积不规则，且各组均可见散在空隙存在（E）。

图1  电子探针下釉质表面超微结构

3讨论

早期釉质龋的主要临床表现为牙面无光泽白垩色病变，此时釉质层相对完整而表层下脱矿严重^[3]。龋病的发生是脱矿与再矿化的动态发展过程，再矿化过程分为生理性和病理性再矿化^[8,9]。在釉质的脱矿过程中，菌斑中的细菌代谢产酸，酸使牙体组织开始明显的脱钙和脱磷^[10,11]。当唾液中的钙、磷可以阻断牙釉质溶解，同时形成的结晶沉积于釉质表面即发生了再矿化^[8]。氟化物促进早期釉质龋再矿化其防龋机制主要是影响牙形态，形成氟磷灰石，降低釉质溶解度促进釉质再矿化。因为过量的氟可导致中毒甚至死亡，其应用受到一定的限制^[1]。此外，在中药化学成分的研究中，绝大多数是用乙醇或，甲醇或酯类物质进行提取，然而中药的传统应用是以浸泡、水煎、煮为主^[12]。因此黄瓜籽醇提取物中得到的黄瓜籽营养成分比较局限。所以，寻找更为安全有效且方便提取用于日常生活的再矿化材料成为釉质龋防治的研究热点。

黄瓜籽为黄瓜的种子来自大自然，是日常食用的食品，也被视为有价值的中药。其中,黄瓜籽中含有大量的钙、磷以离子的形式可以沉积在釉质表面^[6]，以及黄酮多酚物质可能以Ca²⁺结合形成含钙络合物使釉质表面再矿化。有研究已经证实随着黄瓜籽醇提取物的浓度升高促进早期釉质龋再矿化的效果越强^[6]。目前，已有研究证实多种中药成分可以抑制龋病发生，促进再矿化。其中绿茶、普洱茶、柠檬精油、五倍子、柚皮苷、紫地榆等均具有一定的防龋作用。其中黄酮多酚类物质、鞣酸、没食子酸等，均可与釉质的Ca²⁺结合形成含钙络合物，使釉质表面再矿化^[6,13,14]。

在本研究中，CSW可促使脱矿后的釉质再矿化，推测其原因仍可能与黄瓜籽中大量无机矿物质沉积脱矿釉质表面有关，以及黄瓜籽中的甾醇类物质、有机酸类物质可能抑制细菌防龋相关^[15]。但是CSW并未因浓度的升高而促进再矿化的能力增强，有待进一步研究。目前已经研发了，更便捷，敏感性高且可量化的检验釉质脱矿及再矿化的方法^[16]。因为实验条件的局限性，以及本研究中实验样本量不足，并未从定量方面判断脱矿釉质表面再矿化的情况。下一步可以通过加大样本量以及改变检验实验方法及检验结果方式，进一步研究矿化后晶体的成分以及黄瓜籽水提取物及醇提取物的具体成分。

研究证实，CSW对脱矿釉质具有再矿化作用。尽管其没有NaF促进早期釉质龋再矿化明显，但却具有中药所特有的安全性且来源丰富。虽不及黄瓜籽醇提取物促进早期釉质龋随着浓度升高而效果增强，但提取制作过程较为简便，为预防并促进早期釉质龋再矿化提供了新思路，可以进一步将其应用于家庭口腔保健药物，如牙膏、漱口水中，以减少龋病的发生。

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作者简介：王金凤（1993--），女，硕士学位，主治医师，口腔医学，主要从事口腔全科工作。

基金项目:黑龙江省卫生健康委科研课题（20220808011127)