Abstract:Fracture healing is a complex biological process that requires several different immune cells to work together to complete. Inside these immune cells, two types of cells, macrophages and neutrophils, play a particularly important role in the healing process，at the beginning of the fracture, neutrophils are the first immune cells that appear, and they quickly run to the injured place. These cells release some of the substances that can cause inflammation, mainly by cleaning up the bacteria and the necrotic tissue, which will cause the wound to have an inflammatory response.Following this, M1 macrophages release substances that make the inflammatory response more intense and help the body cope with acute inflammation. After a while, M2 macrophages work together, secrete a number of different substances that can help tissue grow, especially in the form of blood vessel formation and bone regeneration. Interestingly, the M2 macrophages begin to function, and they can also help the tissue grow, especially in the form of blood vessel formation and bone regeneration.Better control of the entire process of wound healing and tissue reconstruction.The paper mainly examines how two immune cells, macrophages and neutrophils, work together during fracture healing, and by analyzing their interactions, can help us find better ways to treat fractures. This study lays the foundation for developing new fracture treatments in the future, giving us a clearer idea of how to use immune cells to promote bone healing.

【key word】Fracture Healing  Macrophages   Neutrophils   Cooperative Regulation  Callus Formation

【引言】随着交通工具的快速发展以及人口老龄化程度的加深，骨折的发生几率逐年呈现上升态势^[1]大概5%至10%的骨折患者会出现延迟愈合或者骨不连的情况，此种现象会给患者的身体健康、生活质量以及社会经济等诸多方面带来不利影响^[2]，故而探寻促进骨折愈合进程以及防治相关并发症的有效策略有关键临床意义，骨折愈合是一个涉及炎症、修复以及重塑的多阶段复杂过程，其成功依赖于免疫系统与骨骼微环境的高度协同配合^[3]。近些年来，先天免疫细胞在组织再生过程中所起到的作用受到了广泛的关注，在这些细胞当中，巨噬细胞因其表型可塑性以及功能多样性，被视为调控愈合过程的关键协调者，有研究说明，不同组织内的巨噬细胞会根据环境变化而发生极化，形成不同的巨噬细胞亚型，例如M1巨噬细胞以及M2巨噬细胞^[4]。巨噬细胞一开始会朝着促炎的M1表型极化，凭借这种方式来帮助宿主对抗病原体，随后巨噬细胞会转向抗炎的M2表型极化，对受损组织进行修复，最近巨噬细胞极化的调节已经成功达成，其免疫功能也得到了调控^[5]。同一时刻，中性粒细胞身为最先募集至损伤部位的免疫细胞，其功能以往一直被单纯归结为“短暂杀菌效应器”，然而有研究者发现，中性粒细胞化合物存在延迟释放的现象，这种延迟释放会使得周围的巨噬细胞产生I型干扰素反应，提升巨噬细胞抗炎消肿的功效^[6]。中性粒细胞参与了更为广泛的修复调控进程，其实现方式是依靠吞噬作用，以及凭借释放抗菌物质与中性粒细胞外陷阱等机制来达成^[7]，虽说这两者在骨折愈合过程中都曾被分别进行研究，但是在耦合机制、信号传递通路以及它们对成骨分化所产生的联合影响方面，仍然存在着较为突出的知识空白。此次综述希望能够揭示巨噬细胞和中性粒细胞在骨折愈合当中的协同作用机制，依靠对这一免疫细胞动态网络的分析，本研究可为开发针对免疫微环境的促骨再生策略提供全新视角。

1.骨折愈合的免疫微环境概述

骨折愈合属于一个有高度协调性的再生进程，此进程的最关键的是免疫细胞，像巨噬细胞以及中性粒细胞，它们会和骨祖细胞、成骨细胞以及血管内皮细胞产生动态的相互作用^[8]。骨折愈合从免疫学角度看可划分成三个阶段，分别是炎症期，时间跨度为0至7天，修复期，时间范围是7至21天，以及重塑期，时间超过21天，每个阶段的免疫微环境存在着十分突出的差异^[9]，最初在炎症期的时候，骨折部位的局部血管出现破裂，造成缺氧状况以及细胞碎片的堆积，这使得中性粒细胞迅速浸润^[10]。中性粒细胞会借助释放活性氧（Reactive Oxygen Species）以及胞外诱捕网（Neutrophil Extracellular Traps）的方式，来实现清除病原体以及坏死组织的目的，它还会分泌如白细胞介素 - 1β（Interleukin-1β）、肿瘤坏死因子 -α（TNF-α）等这样的促炎因子，将单核/巨噬细胞募集到损伤部位^[11]。随后便进入修复阶段，在此期间巨噬细胞会在局部微环境的作用下发生极化，这种局部微环境包含乳酸以及凋亡细胞所释放的脂质介质等成分，巨噬细胞会从促炎型也就是M1型，朝着抗炎/促修复型即M2型进行极化转变^[11]，而M2巨噬细胞可分泌转化生长因子 -β（TGF-β）、血管内皮生长因子（VEGF）和血小板衍生生长因子（PDGF）等多种因子，这些因子可以推动间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells）实现成骨分化，并且还可以促进血管生成^[13]。在这个阶段，中性粒细胞的数量出现了减少的情况，不过其残留下来的蛋白酶，像是MMP - 9，依旧会参与到细胞外基质（Extracellular Matrix）的重塑过程当中^[14]，到了最后重塑期的时候，巨噬细胞会对骨保护素（OPG）平衡进行调控，以此介导破骨细胞依赖性的骨改建^[15]，在这个时候，中性粒细胞几乎已经完全消退了，但是巨噬细胞仍然会借助外泌体miRNA，比如miR - 214，来调节成骨细胞的功能^[16]。其他免疫细胞像调节性T细胞、肥大细胞，凭借分泌IL-10、组胺等因子，间接对免疫-骨代谢平衡产生影响^[17]，糖尿病或老龄化这类动态免疫微环境失调情况，会致使骨折延迟愈合或者不愈合，这突出了其作为治疗靶点的意义^[18]。

2.作用于骨折愈合的免疫细胞

2.1巨噬细胞的来源

成年哺乳动物身体内的巨噬细胞源自两个不一样的谱系，分别是胚胎外卵黄囊以及单核细胞，借助细胞命运图谱研究以及巨噬细胞耗竭实验可发现，在小鼠胚胎发育的早期阶段，也就是胚胎第6.5天至8.5天的时候，卵黄囊会产生一类红系-髓系祖细胞（Erythroid-Myeloid Progenitor），这些祖细胞接着会迁移到正在发育的胎儿器官当中并且定植下来，最终分化成为组织驻留巨噬细胞^{[19, 20]}。那些驻留巨噬细胞有自我更新的能力，在成年个体的器官当中，驻留巨噬细胞群体可达成自我维持，即便没有单核细胞进行补充也是如此^[21]。在处于稳态的条件之下，驻留巨噬细胞会作为哨兵的角色来维持器官的稳态情况，然而当感染或者损伤出现的时候，它们有可能会受到额外的刺激，启动恰当合适的免疫反应^{[22, 23]}。成年哺乳动物身体内巨噬细胞的另外一个关键来源是血液循环当中的单核细胞，这些单核细胞源自造血干细胞的定向分化，这个干细胞群在胚胎发育时期主要定位于胎肝，到了成年之后就会转移至骨髓组织完成最后的分化^{[23, 24]}。在组织出现受损状况的时候，血液或者骨髓源性的单核细胞会被吸引募集到损伤的部位，经过终末分化形成成熟的巨噬细胞，在这个时候，创伤处的巨噬细胞群体是由两个亚群共同组合而成的，分别是新分化产生的单核细胞源巨噬细胞以及原位驻留的组织固有巨噬细胞^[25]。虽然目前这两类巨噬细胞亚群之间协同作用的具体程度以及它们在创伤修复过程里相对贡献的情况仍不太清晰，不过研究已经说明，在一些特定的病理过程当中，像是肝损伤所引发的纤维化反应，主要是依靠从血液循环单核细胞分化产生的巨噬细胞群来发挥作用的^[26]。

2.2巨噬细胞在骨折愈合的作用

在骨折愈合的早期阶段，巨噬细胞是调控局部炎症反应的关键靶细胞，当受到炎症刺激时，巨噬细胞凭借代谢重编程推动炎症反应，表现为吞噬功能和细胞因子释放能力提高^[27]。巨噬细胞借助动态表型极化即M1/M2协调炎症反应、组织修复和骨再生，骨折发生后，局部微环境中的损伤相关分子模式（DAMPs）以及细胞因子如CCL2、GM-CSF驱动单核细胞募集并分化为巨噬细胞^[28]。最开始呈现出来的是炎症与修复阶段的表型转换状况，有研究说明在骨折早期即炎症期时，M1表型借助分泌TNF-α、IL-1β以及ROS来清除坏死组织与病原体，同时还会激活间充质干细胞促使其迁移^[29]。进入修复阶段后，M2巨噬细胞依靠释放IL-10、TGF-β以及VEGF来抑制炎症反应，推动血管生成以及软骨痂的形成，并且M2巨噬细胞还可借助Wnt/β-catenin信号直接刺激成骨细胞的分化^[30]，巨噬细胞与破骨细胞前体有共同的祖细胞，这二者会于RANKL/OPG平衡当中对骨吸收以及骨形成起到调控的功效^[31]。可发觉巨噬细胞在细胞间相互作用以及骨再生调控方面发挥着一定作用，巨噬细胞存在成为治疗靶点的潜在可能性，有研究说明，针对巨噬细胞极化展开靶向干预或者对其代谢实施调控，可优化愈合微环境，实验证实，在局部注射M2型外泌体之后，小鼠骨折愈合的时间缩短了30%^[32]。巨噬细胞功能呈现时空特异性，这种精准调控是平衡炎症与再生的关键所在，依靠对其作用机制加以分析可明确，巨噬细胞在骨折愈合早期阶段起到主要作用，在未来研究工作里，要深入剖析巨噬细胞与中性粒细胞协同作用的具体情形以及靶向策略相关内容，以此推动达成临床转化。

2.3中性粒细胞在骨折中的作用机制

中性粒细胞是我们先天免疫反应中的关键细胞，在清除体内细菌和真菌方面起着关键作用^{[33, 34]}，它也是我们体内数量最多的白细胞，占比达60%^[35]，它是免疫系统中相当关键的一部分，凭借抵御机体内部和外部的各种刺激，建立起机体的保护屏障^[36]。骨折后的几个小时内，中性粒细胞会依据趋化因子如CXCL1、CXCL8产生的信号，迅速募集到损伤部位，以清除坏死组织并启动炎症反应^[37]，局部出现缺氧和细胞坏死状况，促使高迁移率族蛋白盒 1（HMGB1）从细胞核释放至细胞外，其氧化状态即还原型或二硫型，可决定炎症强度，还原型HMGB1借助TLR4-MyD88通路激活中性粒细胞，二硫型HMGB1则结合CXCL12提高趋化效应^[38]。在局部炎症刚刚开始之际，会出现迅速形成血肿的现象，这种血肿结构可为免疫细胞以及祖细胞提供支架支持，促使组织再生的过程启动起来^[39]，中性粒细胞源于血液，当从破裂血管渗出后，在骨折发生后的短短数分钟里，就能从循环系统迅速迁移至受损的骨组织内部，并且中性粒细胞及其祖细胞可直接依靠受损骨髓途径侵入血肿，Hoff等学者研究证明，在创伤发生的瞬间，骨折部位形成的血肿中主要含有骨髓来源的细胞成分，其中大部分是CD16+未成熟粒细胞。在72小时以内，可能会出现两种生物学过程，一个是粒细胞完成成熟转化，另一个是循环系统中的CD16+成熟粒细胞向损伤部位浸润^[40]。骨折部位的骨髓呈现出高度的活化情形，研究说明在该区域之中，CD16+阳性细胞的数量持续不断地增多，这意味着骨髓系统针对创伤产生了广泛的激活反应，中性粒细胞的数量在炎症早期快速地聚集于骨折区域，随后呈现出渐进性减少的态势，当到了伤后7-10日的时候，骨膜骨痂之中仅仅残留少量的此类细胞^[41]。

最新研究成果说明，中性粒细胞保持适度活化水平对骨折顺利愈合非常关键，依靠动物实验得知，使用Ly-6G抗体清除中性粒细胞后，单核/巨噬细胞（Monocyte-Macrophage）向骨折部位的迁移效率较大降低，值得注意的是，骨折血肿中IL-6、IL-10、CXCL1、MCP-1等炎症介导因子的表达水平发生异常波动。在中性粒细胞耗竭小鼠模型中，后续骨再生进程明显受阻，这一发现说明，中性粒细胞在骨折愈合过程中发挥着三重关键调控作用，即精确调节局部免疫应答、适时终止炎症反应、启动下游级联修复信号，这些生物学事件共同构成骨组织成功修复的必要条件，Bastian研究团队提供了分子层面的相关证据，他们发现中性粒细胞在骨折初期血肿内可构建由纤维连接蛋白组成的“应急性细胞外基质”，该结构可作为间质细胞定向迁移的分子支架，加速愈合进程^[42]。研究人员开展研究后发现，骨折发生之后，中性粒细胞的早期募集与纤维连接蛋白即 FN 的合成之间呈现出一种时空耦合的现象，借助组织化学染色给予证实，中性粒细胞胞内存在 FN 阳性表达信号，在伤后 3 至 10 天这个时间段内，血肿的总细胞数保持稳定状态，然而细胞亚群分析显示，中性粒细胞的比例持续下降，巨噬细胞与间质细胞正逐渐迁入 FN 基质^[42]。在这当中，FN 的总量维持稳定，而 I 型胶原的含量有所升高，这证实了新迁入的细胞群有活跃的胶原合成功能^{[42, 43]}。凭借这些情况可明确地知晓，中性粒细胞和巨噬细胞在骨折愈合过程里所发挥的作用是紧密关联在一起的。

2.4巨噬细胞与中性粒细胞的协同机制

巨噬细胞跟中性粒细胞于骨折愈合进程里借助时序性协作以及分子信号交互，一起对炎症与修复的平衡加以调控，在骨折初期的24至72小时这个阶段，中性粒细胞身为“第一响应者”快速浸润至损伤部位，经由释放IL-1β、CXCL1/8等趋化因子来募集单核细胞也就是巨噬细胞前体，并且分泌S100A8/A9蛋白去激活局部巨噬细胞的促炎表型即M1，以此放大炎症信号来清除坏死组织^[43]。中性粒细胞的活化依靠Toll样受体4也就是TLR4去识别损伤相关分子模式即DAMPs，这经证实借助NF-κB信号通路促使IL-6以及TNF-α分泌，让巨噬细胞的吞噬功能得到提高^[44]。中性粒细胞凭借NETosis释放的HMGB1以及线粒体DNA，可作为DAMPs直接刺激巨噬细胞的TLR4/9通路，促使巨噬细胞分泌促炎因子，启动组织修复程序^[45]。中性粒细胞来源的S100A8/A9可上调巨噬细胞NLRP3炎症小体活性，促进IL-1β成熟，这一正反馈环路于清除坏死碎片方面发挥着关键作用^[46]。见图1。在修复期开始后的7至14天内，巨噬细胞会经由表型转换，也就是从M1型转变为M2型，以此主动调节中性粒细胞的清除过程以及促使炎症逐渐消退，M2型巨噬细胞可分泌TGF-β以及脂氧素A4，也就是LXA4，借助激活PPARγ通路来抑制中性粒细胞产生ROS，并且推动其发生凋亡^[47]。M2型巨噬细胞会使CCL2以及VEGF出现上调的情况，募集内皮细胞与成骨前体细胞，以此来推动血管生成以及骨痂形成^[48]。

图1 中性粒细胞与巨噬细胞的协同作用

近年来的研究说明，巨噬细胞会借助外泌体将miR-223传递给中性粒细胞，以此抑制中性粒细胞的NLRP3炎症小体活性，减少过度炎症给骨再生带来的负面作用，另外当中性粒细胞的凋亡碎片被巨噬细胞吞噬后，可诱导Arg1和IL-10表达，促使M2极化加速，还会分泌BMP-2来推动成骨分化^[49]。在病理情形之下比如糖尿病或者衰老的状况时，两者协同发挥的作用有可能出现失调的情况，举例来讲，处于高糖环境之中会使得中性粒细胞持续不断地释放MMP - 9对细胞外基质造成破坏，巨噬细胞会停留在M1表型，分泌出过量的IL - 1β来抑制成骨分化，最终使得愈合的进程被延缓^[50]。在衰老模型里，中性粒细胞的线粒体功能出现受损状况，使得 ROS 的清除能力有所下降，巨噬细胞的 SIRT1 表达量减少，致使 M2 极化受到妨碍，最终形成了慢性炎症微环境^[51]。临床前期的研究显示，针对协同节点进行靶向操作，像阻断S100A8/A9或者提高LXA4信号，可对愈合微环境起到优化作用，举例来说，在针对小鼠构建的骨折模型里，抑制S100A8/A9可使M1型巨噬细胞的浸润情况减少，并且加快骨痂矿化的进程^[52]。因此，针对巨噬细胞与中性粒细胞的协同作用进行干预从而缓解骨折患者出现延迟愈合或骨不连有望成为未来治疗骨科康复的新手段之一。

3.总结与展望

巨噬细胞跟中性粒细胞的协同作用在组织损伤修复方面有着时空动态性以及分子精密性，这两者之间的代谢交互比如线粒体ROS调控，以及凋亡碎片清除凭借PPARγ/Arg1轴，可协调炎症消退以及再生平衡，其中借助miR-223的纳米颗粒或许可以成为精准调控炎症与再生平衡的新型工具（表1）。巨噬细胞与中性粒细胞的协同机制是连接炎症跟再生的核心桥梁，该研究为促进骨折愈合，防止骨折后出现延迟愈合以及骨不连的治疗提供了理论基础，未来需要借助跨学科技术像人工智能驱动的靶点预测、类器官模型突破现有的瓶颈，最终达成从分子机制到临床精准干预的转化，然而目前的研究大多依靠小鼠模型，人类免疫微环境的复杂性例如中性粒细胞寿命、巨噬细胞表型可塑性差异可能致使临床疗效出现偏差，有待研究探讨。

表1 巨噬细胞与中性粒细胞协同作用关键机制

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