中图分类号：R284.1

腰椎合剂是楚雄彝族自治州中医医院取得医疗机构制剂批准文号的彝药特色制剂，是骨伤科主要用药之一，具有活血镇痛，散寒除湿的作用，主要用于腰间盘突出症，坐骨神经炎，骨质增生，腰扭伤，腰肌劳损，以及肩周炎，慢性风湿性关节炎（寒湿型），临床疗效确切。该制剂处方中细辛来源为马兜铃科植物北细辛、汉城细辛 或华细辛的干燥根和根茎^[1]，马兜铃科的数种药材被检测出含马兜铃酸，主要为马兜铃酸 I (AA-I)，马兜铃酸 II ( AA-II)，含马兜铃酸的中药可引起肾损害，国内外中医药界对此产生广泛关注^[2-4]。因此，有必要对含有细辛的中药制剂进行急性毒性试验和马兜铃酸I限度检查，以保证临床用药安全性。本文中对腰椎合剂进行急性毒性试验，并建立了LC-MS检测马兜铃酸I的方法，对腰椎合剂中马兜铃酸I的限量测定进行了研究。

1 仪器、试药、动物

1.1  主要仪器  液质联用色谱仪 AB SCIEX Triple Quad 5500，AB SCIEX Triple Quad .

1.2  试药  马兜铃酸I对照品（中国食品药品检定研究院，批号：1107046-201919，含量以99.1%计），甲醇、乙腈（HPLC级，上海星可生化有限公司）；磷酸、冰醋酸、甲酸、甲酸铵(AR级，国药集团)；甲醇、乙腈(MS级，Fisher)。腰椎合剂（批号190818、190820、190822、190824、190906、190908、20220622、230906-3、230919-1、240115-1、240117-3、240329-1、240617-1）、腰椎合剂缺细辛阴性样品（批号230927），由楚雄彝族自治州中医医院中彝药研发制剂中心生产。无菌注射用水（中国医学科学院医学生物学研究所，批号：J2022-06-F）。

1.3 实验动物 SPF 级SD 大鼠，雌雄各半，购入时动物体重范围：180～220g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号：SCXK(京)2021-0011。实验动物饲养于抗高温聚碳酸脂（PC）大鼠笼盒内，饲料为SPF大小鼠维持饲料，由科澳协力（天津）饲料有限公司提供，许可证号：津饲证（2020）01005，饮水为高压蒸汽灭菌水。实验室温度为20~26℃，相对湿度为40～70%，实验动物设施使用许可证：SYXK (滇)K2018-0006。

2 试验方法

2.1 动物分组及动物数  取SPF 级 SD 大鼠40 只（20♀/20♂）。按性别和体重随机分为 2 组，分别为正常对照组，腰椎合剂组（单日3次给药，单次给药剂量 64g/kg，最大给药浓度3.2g/mL。）

2.2 给药方法及观察^[5，6]  试验当天24h 内灌胃给药3 次，每次给药间隔 4 小时以上，给药前动物禁食不禁水过夜，正常对照组给予无菌注射用水，腰椎合剂组给予腰椎合剂溶液，给药容积均为20mL/kg/次（最大给药量）。给药后随即观察动物反应情况，给药当日定时观察，给药后进行连续笼旁观察，次日起每日上午和下午各观察一次，连续观察14d，观察动物体重、行为活动状况，饮食、分泌物、排泄物、中毒表现和特点，毒性反应出现、消失时间、动物死亡时间等出现的所有情况。

2.3 统计学方法  采用 SPSS 18.0 软件进行数据分析，体重、摄食量数据用均数±标准差（）表示，两组间均数比较时，使用独立样本t检验法进行数据分析。P < 0.05时表示差异具有统计学意义。

2.4 色谱条件 色谱柱Phenomenex Kinetex F5, 2.1×150 mm, 2.6 µm；流动相：0.1％甲酸水溶液+5mM甲酸铵为流动相A，甲醇：乙腈=7:3（含1mM甲酸铵）为流动相B。梯度洗脱程序见表1，流速：0.5mL/min；柱温25℃；进样量：5μL；检测器AB Qtra5500。质谱参数见表2。

表1 流动相梯度洗脱程序表

表2 质谱参数表

2.5 溶液配制

2.5.1 对照品溶液  取马兜铃酸I对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加溶剂溶解并定量稀释制成每1mL中约含马兜铃酸I 1µg的溶液。

2.5.2 供试品溶液  取腰椎合剂25mL，置50mL量瓶中，加入70％甲醇20mL，超声处理（功率500W，频率40kHz）40分钟，放冷，用70％甲醇定容，摇匀，离心（10000转/rpm），取上清液即得。

2.5.3 流动相的配制  流动相A：量取1000mL水，加入1mL甲酸与0.3153g甲酸铵混匀，过滤超声脱气。流动相B：量取700mL甲醇与300mL乙腈，加入1mL甲酸与0.0631g甲酸铵，混匀，过滤超声脱气。

3 结果

3.1 急毒试验结果  给药后，腰椎合剂溶液3.2g/mL供试品组大鼠未见急性中毒症状和反应，连续观察14d，正常对照组与腰椎合剂组动物一般状态良好，未发现异常症状；腰椎合剂组与正常对照组比较，体重、摄食量均无统计学差异，试验期间无动物死亡，试验结束安乐死大鼠，大体解剖肉眼检查大鼠脑、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏等主要脏器未见明显异常。结果见表3，表4和表5。

表3 急性毒性试验对大鼠死亡的影响

表4 急性毒性试验对大鼠体重的影响（，n=10）

注：腰椎合剂组与正常对照组比较，*P>0.05

表5 急性毒性试验对大鼠摄食量的影响（，n=10）

      注：腰椎合剂组与正常对照组比较，*P>0.05  

3.2 马兜铃酸I 薄层鉴别  取本品10mL，置25mL容量瓶中，加甲醇适量，超声处理30分钟，放冷，加甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，滤液作为供试品溶液。另取马兜铃酸 I 对照品适量，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取供试品溶液、对照品溶液各10μL，分别点于同一高效硅胶GF254薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-水-甲酸（20:10:1:1）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（254nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上出现的斑点应小于对照品的斑点，或不出现斑点。结果见图1。

1.供试品190818；2.供试品190820；3.供试品190822；4.供试品190824；

5.供试品190906；6.供试品190908；7.马兜铃酸I对照品溶液；8.阴性对照溶液。

图1 马兜铃酸I薄层色谱图

3.3马兜铃酸I含量测定^[7]

测定法：精密量取腰椎合剂供试品溶液和对照品溶液各5μL，分别注入液质联用色谱仪，记录色谱图。按表6 进样序列进样检测。

表6 马兜铃酸I测定进样序列

计算公式：（其中A供：供试品溶液中马兜铃酸I的峰面积；A对：5针对照品溶液中马兜铃酸I的平均峰面积；C对：对照品溶液马兜铃酸浓度，ng/mL。）

结果：空白不干扰样品检测，腰椎合剂缺细辛阴性样品未检测出马兜铃酸I。

对6批腰椎合剂样品进行检测，检测结果表7和表8：

表7 系统适用性数据

表8 供试品检测数据

结果：6批腰椎合剂样品中马兜铃酸I含量范围4.22~13.8 ng/mL。按照最严格的细辛中马兜铃酸I限量标准(不得过3μg/g)，腰椎合剂中细辛处方量为0.040g/mL，根据处方量折算，初步拟定腰椎合剂中马兜铃酸I的限度为120ng/mL，6批次样品中马兜铃酸I含量均低于限度。

4 讨论

按医疗机构制剂再注册及质量标准提升的有关要求，为确保制剂的质量安全，需对含毒性药材的制剂开展重点监测评价工作。不同方法对于马兜铃酸测定的结果有很大差别，其中LC-MS法是目前马兜铃酸含测最灵敏的方法^[8,9]。针对腰椎合剂中细辛所含的马兜铃酸I限度检查，前期采用薄层色谱鉴别法对腰椎合剂中细辛所含的马兜铃酸I开展毒性限量检查研究，结果符合毒性限量检查要求，后以高效液相色谱法进行马兜铃酸I测定的色谱条件、样品前处理方法等的试验摸索，结果均不理想，故考虑采用LC-MS法进行试验，通过本研究建立简便、快捷的马兜铃酸I限量检查方法，对腰椎合剂的质量控制具有重要的指导作用。加强对中药制剂质量管理，为保障人民用药安全，需要医疗机构、监管部门之间共同努力，确保制剂质量^[10]。按药监部门的要求，进行了腰椎合剂安全性相关的研究工作，更好地保障公众用药安全，促进医疗机构中药制剂持续健康发展。

细辛具有祛风散寒、通窍止痛、温肺化饮的功能‚用于风寒感冒、头痛、牙痛、鼻塞鼻渊、风湿痹痛、痰饮喘咳等‚汤剂为其主要运用剂型，所谓的“细辛不过一钱”仅适用于散剂，在评价细辛毒性时，应首先考虑剂型^[11，1,2]。细辛是2020年版《中国药典》收录的唯一马兜铃科中药材，其药材及饮片含马兜铃酸I不得过0.001％，该版药典收载了多种含细辛的制剂，普遍存在尚未进行马兜铃酸限量考察研究，并规定限量标准^[13，14]。有实验证据显示AA-II有潜在的肾毒性和致肿瘤作用，马兜铃酸I与II同时存在的情况下，可提高 AA-I的生物活化，使得 AA-I形成 DNA加合物并介导潜在致癌性的风险更高^[15]。彝药制剂腰椎合剂中AA-I含量虽处于微量水平，但出于安全性的考虑，后续或将尝试深入研究马兜铃酸的含量检测，建立适用于检测腰椎合剂中AA-II含量的方法。

对于含马兜铃酸的中药制剂，做好全过程质量控制管理至关重要，确保临床用药的安全有效也迫在眉睫。从腰椎合剂中马兜铃酸I含量的检测结果来看，存在批间差异稍大的情况，势必要参照其他院内制剂开展质量均一化研究工作，制定的制剂质量控制方法，既要符合制剂生产质量管理规范，又要能确保制剂批间质量稳定^[16]。另外，临床医师在使用腰椎合剂时也应注意控制剂量和用药时间，降低一定肾毒性的风险，不断提高临床用药的安全性和有效性。

参考文献

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京:中国医药科技出版社,2020:240.

[2] 蒋贵仲.中药中马兜铃酸含量的HPLC测定及复方减毒效果的MLA试验研究[D].上海交通大学,2007.

[3] 胡玥,江振洲,张陆勇.中药中马兜铃酸肾毒性研究进展[J].中南药学,2011,09(6)447-450.

[4] 梅全喜,高玉桥,胡世林.应理性对待含马兜铃酸类中药[J].中国药房,2006,17(7):554-556.

[5] 云南省药品监督管理局.云南省医疗机构中药（民族药）制剂研究技术指导原则,2024:116.

[6] 国家食品药品监督管理总局.药物单次给药毒性研究技术指导原则,2014.

[7] 贾金茹,司丹丹,龙志敏等.LC-MS/MS系统对10种马兜铃酸类化合物的检测方案.SCIEX应用支持中心,北京,2024.

[8] 路金才,韩娜,杜晓曦,等.马兜铃酸的测定方法现状分析[J].中草药,2006,37(7):1112-1114.

[9] 刘嘉澍,妙苗,李青,等.LC-MS/MS法测定跳骨片中马兜铃酸I含量[J].亚太传统医药,2021,17(8):67-70.

[10] 王亚军.医疗机构中药制剂安全性研究[J].航空航天医学杂志,2019,30(12):1518-1519.

[11] 胡志祥,王永红,彭崇胜,等.近5年细辛及其制剂中马兜铃酸的研究进展[J].中草药,2010,41(2):318-320.

[12] 宗时宇,刘洋,孙婷婷,等. 细辛毒性及其控制方法研究进展[J].中国药师,2020, 23 (05): 942-945.

[13] 李功辉,陈莎,章军,等.以马兜铃酸为例探讨中药毒性成分限量标准制定方法[J].中国中药杂志,2017,42(4):800-804.

[14] 刘丽娜,那微,张勇帅,等.马兜铃酸肾病研究进展[J].云南中医中药杂志,2025,46(6):94-100.

[15] 田婧卓,刘素彦,高月,等. 论含马兜铃酸中药的风险评估、安全用药与科学监管——马兜铃酸种类不同毒性各异，检控马兜铃酸I/II是关键 [J]. 中国中药杂志, 2022, 47 (14): 3693-3700.

[16] 刘国鹏,李瑞林.院内中药制剂八味柴芍合剂质量均一化的方法研究[J].当代医药论丛,2025,23(04):109-111.