食管黏膜上皮在酸性反流、化学刺激等条件下极易产生过量活性氧（ROS），引发氧化应激并破坏细胞稳态。ROS的持续积累可触发NLRP3炎症小体的组装，使Caspase-1活化并裂解前体IL-1β与IL-18，造成细胞损伤与局部炎症^[1]。氧化信号与炎症反应之间的耦合被认为是上皮屏障功能下降的重要机制；NLRP3炎症小体的激活过程受ROS水平、线粒体功能及离子通量变化的多重调控，其持续活化可放大炎症反应并加速黏膜损害^[2]。目前，关于ROS清除剂在HEEC炎症损伤及NLRP3通路激活中的作用仍缺乏系统实验依据。本研究依托LPS诱导的HEEC模型，观察ROS清除剂干预后细胞内ROS含量及NLRP3相关蛋白表达变化，为探索食管黏膜氧化-炎症相互作用提供实验参考。

1资料与方法

1.1一般资料

实验时间为2023年1月至2024年12月，在某医学院细胞生物学实验中心完成。选取经STR鉴定的人食管黏膜上皮细胞（HEEC）共60份样本，来源统一、状态稳定。细胞采用DMEM高糖培养基（含10%胎牛血清）在37℃、5%CO₂恒温培养箱中维持生长。实验设对照组、LPS诱导组及LPS+ROS清除剂组，每组20份样本，随机分配。各组细胞传代次数保持在3～5代，以减少批间差异。

1.2方法

对照组（n＝20）：对数生长期的HEEC接种于六孔板，仅加入等体积PBS维持24h；随后收集细胞与上清。采用DCFH-DA法测定ROS平均荧光强度，ELISA测定IL-1β与IL-18，Westernblot检测NLRP3/ASC/Caspase-1并以β-actin为内参。同步行NLRP3免疫荧光与DAPI复染，图像分析软件计算平均荧光密度；所有检测每孔技术重复3次、取均值。

LPS诱导组（n＝20）：HEEC长至约80%融合后加入脂多糖（LPS，终浓度1μg/mL）刺激24h，终点收集细胞与上清。用同一批号试剂与同一流程完成ROS检测、IL-1β/IL-18ELISA及NLRP3通路相关蛋白Westernblot；电泳与显影条件与对照组完全一致。执行NLRP3免疫荧光观察聚集信号，采集相同曝光参数的原始图像并做盲法定量。

LPS＋ROS清除剂组（n＝20）：加药前1h以N-乙酰半胱氨酸（NAC，5mmol/L）预处理，随后联合LPS（1μg/mL）持续24h；到时同法收集样本。按对照组与LPS组同一流程完成ROS、ELISA与Westernblot检测，所有样本在一次性完成以降低批间效应。进行NLRP3免疫荧光并与其他两组共片处理、统一显微参数，技术重复3次取均值用于统计分析。

1.3观察指标

（1）ROS水平：采用DCFH-DA荧光探针法检测，结果以平均荧光强度（A.U.）表示，数值越高说明氧化应激越强；

（2）炎症因子：检测上清液中IL-1β与IL-18含量，单位为pg/mL；

（3）蛋白表达：采用Westernblot测定NLRP3、ASC、Caspase-1灰度比值，以β-actin为内参；

（4）免疫荧光信号：评估NLRP3在胞质的聚集程度与平均荧光密度，评分范围0–255。

1.4统计学处理

采用SPSS26.0软件进行数据分析。所有计量资料以均数±标准差（x̄±s）表示，组间比较使用单因素方差分析（One-wayANOVA），两两比较采用LSDt检验。计数资料以率（%）表示，组间比较采用χ²检验。检验水准设α=0.05，双侧检验；P＜0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1细胞内ROS水平

LPS刺激后，HEEC细胞内ROS荧光强度较对照组显著升高（P＜0.001）；NAC干预后较LPS组明显下降（P＜0.001）。

表1各组HEEC细胞ROS荧光强度及组间比较（±s）

2.2炎症因子水平

LPS刺激后，IL-1β与IL-18水平均明显升高，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.001）；NAC干预后两项指标较LPS组显著下降（P＜0.001）。

表2三组细胞NLRP3通路相关蛋白相对表达量比较（±s）

2.3NLRP3通路蛋白表达

LPS刺激后，NLRP3、ASC及Caspase-1蛋白表达量明显升高，较对照组差异有统计学意义（P＜0.001）；经NAC干预后，三者表达水平均显著下降（t=7.642，P=0.000），呈接近对照水平，说明ROS清除剂可有效抑制NLRP3炎性小体激活。

2.4免疫荧光观察

对照组细胞NLRP3信号分布均匀且荧光较弱，LPS组出现明显胞质聚集与高强度亮点，平均荧光密度显著升高（P＜0.001）；NAC干预后荧光强度减弱、分布恢复均一，平均荧光密度降至121.56±10.08，提示ROS清除剂能降低炎性小体聚集水平并改善细胞形态。

3讨论

氧化应激被视为细胞损伤与炎症反应的关键环节。活性氧（ROS）在生理条件下维持细胞代谢平衡，但当其过量生成时，可破坏线粒体膜电位并促发炎症信号。NLRP3炎症小体是连接氧化应激与细胞炎症反应的重要分子平台，ROS的积聚能够促进其组装与活化，导致Caspase-1裂解前体IL-1β和IL-18，引发细胞焦亡及组织炎症。

在人近曲小管上皮细胞模型中，丙酮醛可增强细胞内氧化应激并诱导NLRP3炎症小体相关蛋白上调，而抗氧化剂干预能显著减轻上述变化^[3]。此现象说明ROS不仅是代谢副产物，更是炎症信号的触发因子。类似的机制同样出现在动物模型中，凉血退紫方可通过抑制ROS介导的NLRP3炎症小体活化，降低过敏性紫癜大鼠血管炎症程度，提示氧化信号与免疫炎症在不同组织类型中具有一致性^[4]。

此外TLR9介导的信号通路亦可与ROS-NLRP3轴发生交互，小鼠气道炎症模型显示，阻断TLR9可同时减轻氧化应激水平与炎症小体激活程度，表明多种上游刺激均可汇聚至该信号通路^[5]。综合前述结果，氧化应激、TLR信号及炎性小体活化之间形成正反馈环路，导致上皮细胞炎症持续放大。由此可见，清除过量ROS或阻断NLRP3炎症小体信号，是防止细胞氧化损伤及组织炎症扩散的关键策略。

本实验显示，LPS刺激后HEEC细胞ROS水平上升约91.99%，伴随NLRP3、ASC及Caspase-1表达增强，同时IL-1β与IL-18分泌显著增加。经NAC干预后，ROS下降约35.59%，两种炎症因子下降幅度分别为33.10%和35.42%，差异均有统计学意义（P＜0.001）。说明ROS清除剂能有效缓解氧化应激负荷，阻断炎性小体激活过程，使炎症反应得到控制。

综上所述，ROS清除剂可通过抑制NLRP3通路活化减轻HEEC炎症损伤，改善细胞氧化环境并维持黏膜稳态。本实验提示抗氧化干预在食管黏膜相关疾病中具有潜在应用价值，后续研究可进一步验证其在体模型中的长期效果与安全性。

参考文献

[1]Zhong Z, Zhai Y, Liang S, et al. TRPM2 links oxidative stress to NLRP3 inflammasome activation[J]. Nature communications, 2013, 4(1): 1611.

[2]刘峰,庄万欣,杨媛,等.NLRP3炎症小体激活的调控机制研究进展[J].生物医学转化,2024,5(02):2-11+35.

[3]陈燕玲,罗婷,曾洪敏,等.丙酮醛对人近曲小管上皮细胞氧化应激状态及NLRP3炎症小体信号的作用[J].医学研究生学报,2018,31(3):262-266.DOI:10.16571/j.cnki.1008-8199.2018.03.009.

[4]宋金婉,任献青,邢琼琼,等.基于ROS介导NLRP3炎症小体活化探讨凉血退紫方治疗过敏性紫癜大鼠作用机制研究[J].中国比较医学杂志,2025,35(4):21-30.DOI:10.3969/j.issn.1671-7856.2025.04.003.

[5]赵翠翠.TLR9介导NLRP3炎症小体的活化和氧化应激在小鼠过敏性气道炎症中的作用[D].安徽:安徽医科大学,2021.

基金项日:新疆维吾尔自治区自然科学基金(2022D01C107);新疆维吾尔自治区优秀博士后普通基金资助项目(346798)

作者简介：阿布力克木·吾拉音（1984.10.28），男，维吾尔族，新疆乌鲁木齐市，研究生，主治医师，研究方向：肝胆胰外科

通信作者:克力木·阿不都热依木，主任医师/教授;